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无论采用哪种耗竭方法，携带hkp1的肺对4gy-rt的免疫反应均明显减弱，表现为t细胞向肿瘤胰岛的浸润显著减弱，效应细胞因子的产生减少(cd4+t细胞中的干扰素-γ/肿瘤坏死因子-α和cd8+t细胞中的gzmb)(图4c和扩展数据图6d)。值得注意的是，在hkp1荷瘤小鼠中，棒状细胞缺陷取消了联合治疗的疗效(图4d)。
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电子显微镜对棒状细胞的进一步表征显示，与对照组相比，从4gy-rt治疗的肺中分离出的棒状细胞中分泌囊泡的数量增加(扩展数据图8a，b)。我们推测放疗后棒状细胞的分泌可能在提高icis疗效中起作用。为了解决这个问题，我们使用scgb1a1-creertm/snap23flox/flox转基因小鼠(简称scgb1a1cre/snap23fl/fl)阻止棒状细胞分泌蛋白进入肺tme。突触体相关蛋白23(snap23)是snare复合体的关键成分，它介导细胞内囊泡融合到膜上，调节胞吐。他莫昔芬治疗scgb1a1cre/snap23fl/fl小鼠允许有条件的棒状细胞特异性缺失snap23基因(图5a)，而不改变细支气管的完整性(扩展数据图8c)。对支气管肺泡灌洗液(balf)的分析证实，与野生型对照相比，4gy-rt治疗的scgb1a1cre/snap23fl/fl小鼠的棒状细胞分泌组成分cc10显著减少(图5b)。与棒状细胞消融一致，snap23缺乏抑制了hkp1肺对4gy-rt反应中t细胞的浸润和激活(图5c和扩展数据图8d)。
棒状细胞减少促肿瘤炎症
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球状细胞缺陷(dt治疗)小鼠的肺显示髓系/淋巴细胞比率增加(mye/lym，对照组和dt治疗小鼠分别为和，图6a)。此外，杆状细胞缺陷肺中的髓样细胞表现出炎症介质的表达增加，如il1b、ptgs2和tnf(图6b)，据报道它们可以抑制适应性抗肿瘤免疫。我们推测这些棒状细胞介导的tme改变可能影响了t细胞效应器的表型。使用基于图形的分类，t细胞被分成9个簇(图6c)，每个簇的功能状态根据它们的特征基因来确定(图6c和补充表2)。我们观察到效应t细胞簇(c5)显示细胞因子、效应分子(干扰素-γ和肿瘤坏死因子)和t细胞活化标志物(pdcd1和ctla4)表达增加，增殖t细胞簇(c9)显示颗粒酶和ki67表达，调节性t细胞簇(c8)显示foxp3和il2ra表达(图6c)。值得注意的是，与对照组(分别为和)相比，去杆状细胞(dt治疗)降低了效应器、增殖t细胞和treg细胞的比率((c5+c9)/c8)。总之，这些scrna-seq结果表明，rt激活的棒状细胞的存在有助于适应性抗肿瘤免疫，可能是通过限制hkp1肿瘤中髓系细胞介导的炎症。balf样本的elisa检测显示，与0gy对照组相比，4gy-rt显著降低了hkp1 tme中il-1β、pge_2和tnf-α的水平(图6d)，但在没有棒状细胞(dt处理的scgb1a1cre/idtr)或其分泌体(scgb1a1cre/snap23fl/fl)的情况下，4gy-rt未能减少这些炎症因子(图6d)。为了证明rt诱导的棒状细胞分泌体的临床相关性，我们在ii期新辅助临床试验(nct02904954)54中评估了接受rt联合icis(抗pd-l1)治疗的nsclc患者的血浆水平。分别于首次立体定向全身放射治疗(sbrt)前1d和末次sbrt后1d采集血浆。匹配患者的cc10血浆浓度比较(放疗前和放疗后)显示，大多数获得病理改善的患者在放疗后血浆cc10水平升高(8人中有5人)，而无反应的患者(9人中有0人，p=)(图6e)，表明棒状细胞激活与联合治疗的病理反应有关。综上所述，这些发现表明，rt激活的棒状细胞通过其分泌体抑制了hkp1肺中的肿瘤前炎症，从而增强了适应性抗肿瘤免疫。
棒状细胞因子改善pd-1受体阻滞剂的疗效
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这些体外研究结果促使我们研究棒状鸡尾酒是否能反映4gy-rt在改善体内pd-1阻断方面的效果。我们每天给hkp1小鼠鼻内注射棒状鸡尾酒(每只小鼠每只蛋白20 ng)，连续3d(第11-13天)，并联合pd-1抗体(图8a)。值得注意的是，与模拟对照相比，联合pd-1抗体的棒状鸡尾酒治疗可显著控制肿瘤并提高hkp1小鼠的存活率(图8b，c)。与4gy-rt相似，支气管肺泡灌洗液分析显示，与对照组相比，棒状鸡尾酒治疗组小鼠的肿瘤坏死因子-α、前列腺素e_2和il-1β水平较低(图8d)。最后，为了确定棒状鸡尾酒和pd-1抗体联合治疗是否能产生持久的抗肿瘤免疫，我们进行了肿瘤再攻击实验。事实上，与对照组相比，存活的小鼠在3-5天内清除了肺部的肿瘤细胞(扩展数据图10e)。总之，这些发现表明，棒状细胞分泌蛋白通过抑制免疫抑制的mdscs和增强t细胞功能来提高pd-1阻断的疗效。
?研究小结?
在nsclc模型中，确定了一种特定剂量的rt，当与icis联合使用时，该剂量可使肿瘤消退并提高存活率。
rt的免疫调节作用归因于激活的肺居留scgb1a1+棒状细胞。值得注意的是，具有棒状细胞特异性突触体相关蛋白23基因敲除的小鼠未能从联合治疗中受益，这表明棒状细胞分泌体起着关键作用。
我们鉴定了八种棒状细胞分泌蛋白，它们可以抑制免疫抑制的髓样细胞，减少肿瘤前炎症，增强抗肿瘤免疫。值得注意的是，联合治疗后nsclc患者血浆中棒状细胞分泌组成员cc10水平升高。
?讨论?
我们的观察结果与主流观点一致，即rt联合icis可引起抗肿瘤反应。值得注意的是，我们的研究提供了一种机制，通过辐射诱导驻肺的scgb1a1+棒状细胞分泌增强icis对非小细胞肺癌的治疗效果。越来越多的证据表明，与促癌炎症相关的免疫抑制微环境构成了癌症免疫治疗成功的主要障碍，并提出了以炎症为靶点来提高icis疗效的建议。与已报道的棒状细胞在过敏、哮喘和copd中的抗炎作用一致，我们展示了rt激活的棒状细胞分泌蛋白在非小细胞肺癌中的耐人寻味的作用，它可以对抗多种免疫抑制介质，增强适应性抗肿瘤免疫。从我们的研究中得到的见解在临床翻译中具有显著的潜力。目前，由于特定物种的辐射敏感性和靶区体积的差异，目前缺乏将放射剂量从动物模型转换到人类以及反之亦然的标准。然而，我们的研究表明，未来的人类非小细胞肺癌临床试验应该考虑优化一种能有效介导肺部常驻棒状细胞激活的放射治疗剂量。目前，缺乏在不损害肺上皮完整性的情况下激活棒状细胞的药理学或遗传学方法。证明给予棒状细胞鸡尾酒增强了icis的疗效，在开发这些因素作为非小细胞肺癌的治疗方式方面具有巨大的潜力。进一步的研究需要确定能够产生强有力的治疗效果的分泌因子的最佳组成。值得注意的是，sbrt提高了对新辅助sbrt+icis治疗有反应的nsclc患者的cc10水平，这一发现表明，rt诱导的血浆中的棒状细胞分泌因子可能有可能作为对sbrt/icis治疗有反应/无反应的非侵入性生物标志物。总之，来自我们研究的见解有可能为未来的临床试验提供指导，使放射和免疫治疗组合的有效性最大化，以提高病理应答率和改善非小细胞肺癌患者的存活率。
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